2022年WHO報(bào)告稱恒牙齲齒是見(jiàn)的口腔疾病，影響超20億人。變異鏈球菌（S. mutans）作為主要致齲菌，其數(shù)量監(jiān)測(cè)對(duì)齲病預(yù)測(cè)有重要意義。然而，傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法如：培養(yǎng)基法，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，具有耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，涉及昂貴儀器等缺點(diǎn)。

近年來(lái)，電化學(xué)傳感器憑借成本低、耗時(shí)短、高特異性和快速響應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，為細(xì)菌檢測(cè)開(kāi)辟了新平臺(tái)。針對(duì)S. mutans，研究人員已開(kāi)發(fā)出一系列以抗體、抗菌肽、和凝集素為識(shí)別元件的傳感器，但較差的靈敏度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性限制了傳感器在真實(shí)唾液中的檢測(cè)應(yīng)用。此外，唾液中多種成分之間存在干擾，對(duì)檢測(cè)造成困難。如何提高選擇性仍是便攜式唾液傳感器實(shí)際應(yīng)用的研究難點(diǎn)。

近期，長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所張強(qiáng)研究員與吉林大學(xué)口腔醫(yī)院韓光紅副主任醫(yī)師合作，開(kāi)發(fā)了一種基于適配體/細(xì)菌印跡聚合物的（aptamer/SIP）非酶類雙識(shí)別元件的便攜式唾液傳感器，其以羧基化多壁碳納米管（c-MWCNTs）為基底材料，亞甲基藍(lán)（MB）為嵌入式氧化還原探針，并集成了絲網(wǎng)印刷電極（SPE）（圖1）。與其它的S. mutans傳感器相比，本研究所制備的的便攜式唾液傳感器表現(xiàn)出更高的靈敏度（564.0 nA/dec）、更低的檢測(cè)限（LOD，2.6 CFU/mL）和更寬的線性檢測(cè)范圍（102 ~ 10? CFU/mL）。此外，該傳感器能夠原位即時(shí)檢測(cè)真實(shí)唾液樣本中的S. mutans，在臨床齲病預(yù)測(cè)和早期診斷中表現(xiàn)出巨大潛力。

首先，研究人員通過(guò)CA方法將c-MWCNTs電沉積在SPE電極上，并研究電沉積時(shí)間對(duì)電化學(xué)性能的影響。S. mutans特異性適配體一端修飾有氨基，通過(guò)與c-MWCNTs電極上的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的共價(jià)鍵結(jié)合。通過(guò)XPS分析和CV表征確認(rèn)了適配體的成功固定。隨后，采用CV在-0.8 ~ +0.9 V的電位范圍內(nèi)，將S. mutans、吡咯單體和MB電沉積在aptamer電極上，獲得PPy/S. mutans電極。結(jié)果顯示，-0.28 V和-0.14 V處顯示為MB的還原和氧化峰，0.9 V處顯示為吡咯的氧化峰。當(dāng)CV電沉積圈數(shù)為15圈時(shí)，電極電化學(xué)性能。通過(guò)SEM觀察到PPy/S. mutans電極表面覆蓋有球狀的S. mutans（菌體直徑約為0.6 ~ 1 μm）和不規(guī)則的聚吡咯球體。EDS能譜圖顯示出S. mutansMg元素和P元素。以上結(jié)果均證明S. mutans的成功電聚合。采用/Triton X-100去除S. mutans后，即獲得aptamer/SIP電極。CV曲線中觀察到電流明顯增加，MB還原峰在-0.45 V處。隨后，通過(guò)CA在-0.45 V電位下研究了吡咯濃度、S. mutans聚合濃度和洗脫劑種類對(duì)S. mutans傳感器電化學(xué)性能的影響。

為進(jìn)一步驗(yàn)證S. mutans的成功去除，研究人員使用SEM對(duì)aptamer/SIP電極進(jìn)行形貌表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEM圖像中未觀察到顆粒狀的S. mutans。隨后，采用CV和EIS對(duì)aptamer/SIP電極的電化學(xué)性能進(jìn)行研究。在掃描速率為25 ~ 200 mV/s的條件下，記錄了aptamer/SIP電極在5 mM K?Fe(CN)?溶液中的CV曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化還原峰的強(qiáng)度與掃描速率的平方根呈線性相關(guān)，表明該電極的電化學(xué)反應(yīng)受擴(kuò)散過(guò)程控制。同時(shí)，EIS結(jié)果顯示，去除S. mutans后，Rct從4911 Ω減小到2303 Ω，界面電阻明顯減小。表明去除低導(dǎo)電S. mutans后，電極表面創(chuàng)建了大量的電子傳輸路徑，從而顯著提高電極的電化學(xué)活性。

如圖4所示，采用CA方法在-0.45 V電位下，對(duì)含有10 ~ 10? CFU/mL S. mutans濃度范圍的人工唾液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電流值隨S. mutans濃度負(fù)對(duì)數(shù)值的增加而線性減少。與現(xiàn)有其它的S. mutans傳感器相比，該S. mutans傳感器具有更高的靈敏度（564.0 nA/dec），和更低的LOD（2.6 CFU/mL）。此外，該傳感器線性響應(yīng)范圍（102 ~ 10? CFU/mL）覆蓋了人類生理和齲病狀態(tài)下的唾液S. mutans水平，允許直接檢測(cè)實(shí)際唾液樣本，而無(wú)需稀釋。為評(píng)估雙識(shí)別傳感器的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，制備不含有適配體的單識(shí)別元件SIP傳感器。相同條件下，SIP傳感器的靈敏度為193.1 nA/ dec，檢測(cè)限為7.6 CFU/mL，并表現(xiàn)出較窄的線性檢測(cè)范圍103 ~ 10? CFU/mL。結(jié)果表明適配體在提高傳感器的檢測(cè)靈敏度方面起著重要作用。此外，S. mutans傳感器也展現(xiàn)出了良好的選擇性和重現(xiàn)性，并能夠在60天內(nèi)保持對(duì)S. mutans的高效傳感，具有優(yōu)異的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

為評(píng)估S. mutans傳感器的實(shí)際應(yīng)用潛力，研究人員將其用于檢測(cè)健康人群真實(shí)唾液樣本中的S. mutans。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著S. mutans濃度從103 CFU/mL增加到10? CFU/mL，電流值隨S. mutans濃度負(fù)對(duì)數(shù)值的增加而線性減少。在真實(shí)唾液中該傳感器表現(xiàn)出307.0 nA/dec的靈敏度和4.8 CFU/mL的LOD值，能夠進(jìn)行真實(shí)唾液中S. mutans的準(zhǔn)確定量，具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

總之，本研究開(kāi)發(fā)了一種基于雙識(shí)別元件的便攜式生物傳感器，用于迅速檢測(cè)唾液中S. mutans，為齲病早期預(yù)測(cè)提供了潛力。該傳感器具有出色的靈敏度、高選擇性和良好的穩(wěn)定性，可長(zhǎng)期實(shí)際應(yīng)用。通過(guò)固定適配體和SIP雙識(shí)別元件，創(chuàng)建S. mutans特異性印跡空腔和高選擇性傳感界面。MB作為氧化還原探針嵌入SIP網(wǎng)絡(luò)中，在S. mutans結(jié)合反應(yīng)期間提供直接的電信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)S. mutans的原位即時(shí)檢測(cè)。此外，該傳感器不含任何抗體或其它蛋白質(zhì)等易失活物質(zhì)，消除了傳感器因長(zhǎng)期使用而帶來(lái)的信號(hào)下降風(fēng)險(xiǎn)。該傳感器成功應(yīng)用于真實(shí)唾液檢測(cè)，突出了其在臨床防齲和個(gè)性化口腔健康監(jiān)測(cè)方面的巨大潛力。

來(lái)源：傳感器專家網(wǎng)